Media Fill - Die automatische Auslesung von Media Fill-Einheiten durch Headspace-Analytik
Bereits zum 4. Mal trafen sich Verantwortliche für Reinräume, Hygieniker und Mikrobiologen zum regen Informationsaustausch auf der Aseptikon im vergangenen September. Dort wurde neben den zwei etablierten Themengebieten Aseptik und Mikrobiologie erstmals auch über Radiopharmaka und patientenindividuelle sterile Zubereitungen referiert und diskutiert. Im Folgenden wird eine sehr interessante Arbeit von David Brückner (Doktorand der Universität Basel und F. Hoffmann- La Roche Kaiseraugst), in Kollaboration mit dem RMM Team von Novartis Pharma Stein, zur automatischen Auslesung von Media Fill Einheiten mittels Headspace Analytik zusammengefasst.
Der Media Fill gilt als Herzstück der Validierung eines aseptischen Prozesses und hat daher einen sehr hohen Stellenwert. Dabei wird mehrmals jährlich eine an die Routine angelehnte Abfüllung eines Nährmediums durchgeführt. Bei größeren Anlagen werden meist über 10'000 Einheiten abgefüllt, welche anschließend inkubiert und nach 7 und 14 Tagen per Auge ausgewertet werden. Diese Arbeit benötigt ca. 120-140 Stunden, gut geschulte Mitarbeiter und einen klar definierten Arbeitsablauf. Somit drängt es sich auf, diesen Prozess zu automatisieren. Als geeignetes System kommt die nicht-invasive Headspace Analytik (z.B. mit dem System von Lighthouse, Abb. 1 und 3) in Frage. Hier wird die Tatsache genutzt, dass wachsende Mikroorganismen Zucker fermentieren, dabei CO2 abgeben und O2 verbrauchen und über die Messung des CO2/ O2 Gehaltes nachgewiesen werden können. Eine Ausnahme bilden die Homo-Fermenter, die in der Lage sind, ohne O2 Zucker zu Milchsäure (Lactat) abzubauen und dabei kein CO2 abgeben. Sie wurden deshalb mit spezieller Aufmerksamkeit behandelt, zumal sie als potentielle Risikogruppe für falsch negative Resultate kategorisiert wurden.
Abbildung 1: Der Headspace wird mit einer Frequenz modulierten TDLAS Laser Diode (tunable diode laser absorption spectroscopy) auf seinen CO2/O2-Gehalt gemessen. Mittels diverser Messpunkte können O2-Verbrauch und CO2-Produktion grafisch dargestellt werden (siehe Abb. 3).
Die Arbeit von D. Brückner beinhaltete folgende Teilaspekte:
1. Validierung der Robustheit und Reproduzierbarkeit der Methode.
2. Ermittlung des Zeitpunktes der Detektion.
3. Vergleich mit der traditionellen Methode.
4. Evaluation der Detektionsgrenze mittels minimaler Beimpfung (<10 KBE).
5. Einfluss von Leckagen auf die Güte der Messresultate.
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Endotoxin and Pyrogen Testing
Die Robustheit und Reproduzierbarkeit wurde mit einem Modellorganismus (Bacillus subtilis), drei verschiedenen TSB-Lots an einem 2 ml Format gezeigt und bestätigte die grundsätzliche Funktionalität der Methode (Abb. 2).
Abbildung 2: Sauerstoff-Profile: Robustheit und Reproduzierbarkeit wurde am Modellorganismus Bacillus subtilis untersucht. Hier das O2-Profil der drei verschiedenen TSB Lots. Die visuelle Detektion aller beimpften Media Fill Container erfolgt nach 35 Stunden (rote Linie).
Für die Untersuchung des Detektionszeitpunktes wurden 7 ATCC-Referenzstämme, 7 Hausisolate, 5 obligate Homo-fermenter und ein Wasserbakterium verwendet. Um den Detektionszeitpunkt genau bestimmen zu können, wurden vorerst unbeimpfte Media Fill Behälter auf ihren CO2- und O2-Gehalt analysiert. Ein minimaler Anstieg der CO2- und Abfall der O2-Konzentrationen über die Zeit war zu beobachten (Baseline Parameter). Der Detektionszeitpunkt (Schnittpunkt Baseline Parameter mit Wachstumsprofil des jeweiligen Mikroorganismus) lag für die ATCC-Referenz stämme zwischen 34 und 145 Stunden, wobei der Schimmelpilz Aspergillus brasiliensis für seine Detektion am längsten (145 Stunden) benötigte.
Abbildung 3: Beispiel eines O2- und CO2-Profiles im Rahmen der Evaluation des Detektionszeitpunktes.
Die größte Herausforderung stellen die obligaten Homo-Fermenter dar. Obwohl sie gemäß Lehrbuch kein CO2 erzeugen, können sie nachgewiesen werden, benötigten aber in einzelnen Fällen bis zu 9 Tage Inkubation.
Interessanterweise war die optische Auslesung etwas schneller als die Headspace Analytik. Die Homo-Fermenter konnten im Durchschnitt zwischen 47 und 215 Stunden erkannt werden, mittels der optischen Auswertung zwischen 35 und 193 Stunden. Aufgrund dieser Resultate drängt es sich auf, in der Routine die Einheiten z.B. nach 5, 10 und 14 Tagen auszulesen. So steht in den meisten Fällen schon nach 5 Tagen ein Ergebnis bereit und nach 10 Tagen könnte die Auslesung abgeschlossen werden. Dennoch misst man die 14 Tage, damit der Prozess mit der Vorgabe der Regularien compliant bleibt.
Abbildung 4: Beispiel der O2- und CO2-Profile im Rahmen der Leckage-Studie. Links die Profile von Bacillus subtilis für das 50 ml Format und rechts die Profile für das 2 ml Format.
Als Letztes wurde die Messfähigkeit bei Leckagen untersucht. Hier war die Fragestellung, ob die Veränderung der CO2- und O2- Konzentrationen im Headspace des Behälters, trotz einer Undichtigkeit, noch immer messbar ist. Auch hier konnte gezeigt werden, dass die Methode funktioniert. Bei den 50 ml Formaten zeigten sich die Profile praktisch unverändert, während die 2 ml Formate, vor allem während der Wachstumsphase, etwas weniger Konstanz aufwiesen (Abb. 4). Nichtsdestotrotz konnte in allen Fällen zu jedem Zeitpunkt ein Wachstum erkannt werden, was insofern das Risiko eines falsch negativen Resultats auf Grund einer Leckage fast vollständig ausschließt.
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Alternative and Rapid Microbiological Methods
Zusammenfassend konnte mit der Studie gezeigt werden, dass keiner der 20 untersuchten Mikroorganismen ein falsch-negatives Resultat erzeugte. Sogar die Homo-Fermenter konnten nachgewiesen werden. Die Robustheit und Reproduzierbarkeit ist gegeben und auch bei Leckagen ist ein Wachstum gut detektierbar. Der Zeitpunkt bis zur absoluten Detektion ist etwas länger als bei der traditionellen Methode, dennoch stellte dies bei den untersuchten Mikroorganismen kein Problem dar, da alle innerhalb von 10 Tagen detektiert werden konnten. Die Vorteile der Methode sind offensichtlich:
1. Es wird enorm viel Zeit gespart,
2. die Datenintegrität ist besser und
3. die Methode ist objektiver. Dadurch erreicht man schlussendlich eine höhere Produktsicherheit und steigert die Effizienz im Betrieb.
Autor:
Dr. Marcel Goverde
... ist Gründer und Geschäftsführer der MGP Consulting mit Schwerpunkt auf Beratung, Schulung und Projektmanagement im pharmazeutischen GMP-Umfeld und im Besonderen in Mikrobiologie, Hygiene und Abweichungsmanagement.
